مهندسی متابولیک مسیر موالونات برای تولید لینالول در مخمر ساکارومایسس سرویزیه

مونوترپنوئیدها ساده ترین دسته ترپنوئیدها می باشند و تنها از 10 اتم کربن (دو واحد ایزوپرن) تشکیل شده اند و عمده ترین اجزا روغن های ضروری گیاهی را تشکیل می دهند. بیش تر اعضای این خانواده از ترکیبات طبیعی، توسط مونوترپن سینتازها یا سیکلازها که تبدیل جرانیل دی فسفات را به والد حلقوی اسکلت مونوترپن های متعدد کاتالیز می کند، ساخته می شوند. جرانیل دی فسفات یک ترکیب غیر حلقوی حدواسط 10 کربنه در بیوسنتز ایزوپرنوئیدها می باشد. در گذشته بیشتر مطالعات به روی تولید یک مسیر هترولوگوس خاص برای تولید مونوترپنوئیدها در escherichia coli متمرکز شده بود اما امروزه میکرواورگانیسم های یوکاریوتی مانند مخمر ساکارومایسس سرویزیه به دلیل مشخصات خاصشان به عنوان یک میزبان میکروبی مناسب برای بیان ژن های فعال یوکاریوتی مورد توجه قرار گرفته اند. ساکارومایسس سرویزیه قادر به تولید و ترشح کارآمد مونوترپن ها نمی باشد که علت عمده آن عدم حضور آنزیم های مونوترپن سینتاز در این میکرواورگانیسم است. در این مطالعه به وسیله ابزار مهندسی متابولیک مسیر بیوسنتز ایزوپرنوئیدها در مخمر ساکارومایسس سرویزیه، با بیان ژن تولیدکننده آنزیم لینالول سینتاز تغییر داده شد. این آنزیم از جرانیل پیروفسفاتی که طی مسیر موالونات در مخمر تولید می شود، به عنوان سوبسترا استفاده کرده و آن را به لینالول تبدیل می کند. لینالول یک مونوترپن غیرحلقوی است که در رایحه گل های بسیاری از گیاهان یافت می شود و علاوه بر مصرف گسترده در صنعت، در درمان سرطان سینه و لوسمی نیز کاربرد دارد. ژن لینالول سینتاز از گیاه اسطوخودوس به وکتورهای بیانی متفاوتی از ساکارومایسس سرویزیه وارد شد. این وکتورهای بیانی تحت کنترل 4 پروموتور ساختاری با قدرت های متفاوت ناشی از ژنهای کدکننده سیتوکروم c اکسیداز (cyc1)، الکل دهیدروژناز(adh)، گلیسر آلدهید 3 فسفات دهیدروژناز(gpd) و فاکتور طویل سازی ترجمه 1 آلفا(tef) ، می باشند. سپس این وکتورهای بیانی به درون مخمر ساکارومایسس سرویزیه انتقال داده شدند و حضور ژن لینالول سینتاز با آنالیز pcr به روی dna ژنومی مخمر تائید شد. میزان بیان ژن فعال لینالول سینتاز در مخمرهای دستورزی شده توسط اندازه گیری انتشار لینالول با استفاده از میکرو استخراج فاز جامد اندازه گیری شد. نتایج به دست آمده میزان بیان لینالول در مخمرها را تا میزان 4 میکروگرم در لیتر تائید کرد. همچنین سیستم های بیانی متشکل از پروموتورهای ذکر شده که با ترمیناتور(خاتمه دهنده) cyc1 همراه بودند با یکدیگر مقایسه شدند و مشخص شد که میزان بیان ژن لینالول سینتاز در وکتورهای بیانی با پروموتور gpd نسبت به بقیه بیشتر است. میزان بیان ژن مذکور تحت تاثیر پروموتور tef بیشتر از adh بود ولی نشانه ای از بیان ژن در وکتورهای تحت کنترل پروموتور cyc1 ارزیابی نگردید.